Τον επόμενο χρόνο βρίσκει μια νέα θέση στο πανεπιστήμιο της Πάδουα όπου διδάσκει γεωμετρία, μηχανική και αστρονομία. Αναπτύσσει ένα συναρπαστικό αφηγηματικό στυλ και συγκεντρώνει στις διαλέξεις του πλήθος φοιτητών. Το 1604 εκδίδει ένα σύγγραμμα πάνω στην πυξίδα, εκφράζει την άποψη για έναν παγκόσμιο νόμο στον οποίο υπακούουν όλα τα αντικείμενα του σύμπαντος και υποστηρίζει την ηλιοκεντρική θεωρία το Κοπέρνικου. Το 1609 μαθαίνει για την ανακάλυψη του τηλεσκόπιου από τους Ολλανδούς και σύντομα κατασκευάζει ένα δικό του, σε βελτιωμένη έκδοση. Με αυτό παρατηρεί τον ουρανό και το 1610 δημοσιεύει τον «Αστρικό αγγελιοφόρο» με πληροφορίες για την Σελήνη και την κίνηση των ουράνιων σωμάτων, έχοντας επιβεβαιώσει την ηλιοκεντρική θεωρία. Το 1612 διορθώνει την αριστοτέλεια άποψη για τον λόγο που επιπλέουν τα σώματα στο νερό, αποδεικνύοντας πως επιπλέουν λόγω της συσχέτισης του βάρους και της ποσότητας που εκτοπίζεται και όχι λόγο του σχήματος όπως υπέθετε ο Αριστοτέλης, ενώ το 1613 καταρρίπτει μια ακόμη αριστοτελική πεποίθηση, τα ουράνια σώματα τελικά δεν είναι τέλειες σφαίρες. Ο Γαλιλαίος υποστήριζε πως η αυθεντική γνώση εξασφαλίζεται με την άμεση παρατήρηση και έπλεε από καιρό σε επικίνδυνα ύδατα καθώς ερχόταν σε σύγκρουση με του σοφούς της εποχής, ανατρέποντας την μία μετά την άλλη τις στάσιμες ιδέες του Μεσαίωνα και τις αυθεντίες της καθολικής εκκλησίας. Το 1616 προειδοποιήθηκε από την εκκλησία πως δεν πρέπει να πιστεύει, να διδάσκει ή να υποστηρίζει για κανένα λόγω την ηλιοκεντρική θεωρία που έβγαζε την γη από το κέντρο του σύμπαντος και εκείνος για 7 χρόνια συμμορφώθηκε για να γλιτώσει από την Ιερά εξέταση. Το 1623 ωστόσο δημοσιεύει τον «Διάλογο» όπου συζητούν ένας υποστηρικτής του ηλιοκεντρικού και ένας του γεωκεντρικού συστήματος, ο Γαλιλαίος υποτίθεται πως είναι ουδέτερος και δεν παίρνει θέση αλλά στο βιβλίο γίνεται ξεκάθαρο πόσο ανόητος και άνευ επιχειρημάτων είναι ο οπαδός του γεωκεντρισμού. Ο Γαλιλαίος κλήθηκε δίχως καθυστέρηση στην Ρώμη για εξηγήσεις, σχεδόν ένα χρόνο κράτησε η δίκη του μέχρι τον Ιούλιο του 1633. Αναγκάστηκε να απαρνηθεί την θεωρία του για να γλιτώσει την πυρά μα και πάλι καταδικάστηκε σε ισόβιο κατ’ οίκον περιορισμό και σε απαγόρευση δημοσιεύσεων. Παρόλα αυτά το 1638 κυκλοφόρησε στην Ολλανδία το βιβλίο του «Δύο επιστήμες» όπου ανακεφαλαιώνει το έργο της ζωής του και εισάγει και την έννοια της αδράνειας, απόδειξη ότι ακόμη και τα τελευταία του χρόνια και κλεισμένος στο σπίτι συνέχιζε τα πειράματα και τις μελέτες. Πέθανε στο σπίτι του κοντά στην Φλωρεντία τις 8 Ιανουαρίου 1642, από υψηλό πυρετό και καρδιακά προβλήματα. Ζούσε από το 1600 με την Μαρίνα Γκάμπα, με την οποία δεν παντρεύτηκαν ποτέ και είχαν 3 παιδιά. Οι δύο κόρες του κλείστηκαν μεγαλώνοντας σε μοναστήρι ενώ ο γιος του έγινε πετυχημένος μουσικός. Το 1992 ο πάπας Ιωάννης Παύλος θα εκφράσει την λύπη του για το πώς αντιμετώπισε η εκκλησία την υπόθεση Γαλιλαίου.